Ekstraksi, Purifikasi, dan Karakterisasi Lipopolisakarida dari Escherichia coli dan Salmonella typhi

Intisari terjemahan jurnal mikrobiologi (Rezania et all. 2011. Extraction, Purification and Characterization of Lipopolysaccharide from Escherichia coli and Salmonella typhi. Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran. ). 

Lipopolisakarida (LPS) merupakan komponen luar utama membran sel bakteri Gram negatif. struktur dasarnya terdiri dari tiga bagian yaitu sebuah lipid, inti oligosakarida dan polisakarida. LPS menyebabkan efek patofisiologi seperti demam, leukopenia, dan leukositosis, dll. karena peran LPS yang menyebabkan banyak penyakit, sehingga mendorong para peneliti untuk melakukan studi yang diarahkan pada isolasi dan pemurnian.

Prosedur ekstraksi dan purifikasi yang digunakan yaitu dengan metode hot aqua fenol. metode ini menghasilkan tingkat kemurnian yang tinggi dengan kontaminasi protein dan asam nukleat yang sangat rendah.

Purifikasi LPS di evaluasi dengan pewarnaan silver dan coomassie blue gel SDS PAGE dan analisis HPLC. dan untuk menegaskan aktifitas fungsional LPS murni dengan uji koagulasi limulus Amebocyte lysate  (LAL) dan uji pirogen kelinci.

Metode 

HASIL

LPS murniyang ditandai dengan elektroforesis SDS-PAGEdiikuti oleh pewarnaan silver dancommassie blue dan HPLC. Hasil pewarnaan silver jelas menunjukkan Pola tangga band dengan beberapa anak tangga yang merupakan karakteristik dari jenis bakteri Gram negatif karena variasi panjang rantai karbohidratpadabagianO-antigen. LPS dapat diklasifikasikan menjadi jenis halus dan kasar berdasarkan ada atau tidak adanya struktur seperti tangga. Bentuk LPS kasartidak memiliki struktur sepertitanggakarena kurangnya rantai 'O' spesifikyang mengandung unitoligopolysaccharides.

Perlu dicatat bahwa adavariasi dalam beberapa profil pitaLPS dari E.coli dan S.typhi yangterletakpadaperbedaan pada struktur LPS. Variasi inipada struktur dasar LPS untuk berbagaisusunankimiayang diamati pada bakteri Gram negatif. Hasil pewarnaan commassie bluedariLPS murnimengungkapkan adanya kontaminasi protein bakteri, untukefektivitas penghapusan protein yaitudengan perlakuanproteinase. Hasil pewarnaan silver dikonfirmasi dengan analisis HPLC yang menunjukkan sebuah band LPS murni pada kedua kasus.

Analisis HPLC

Uji koagulasi limulus Amebocyte lysate  (LAL) 

Prinsip LAL assay koagulasi di dasarkan pada endotoksin yang mengaktifkan proenzim Limulus Amebocyte Lysate  (LAL), menghasilkan pembentukan gel, hasil uji koagulasi LAL kualitatif menunjukkan aktifitas fungsional LPS murni seperti yang di tunjukkan oleh pembentukan gel pada vial yang berisi LAL.

Ui Pirogen Kelinci

Suhu rektal awal dua kelinci adalah 38,3 dan 38,4 derajat celcius. injeksi LPS dari E. coli dan S. typhi menyebabkan meningkatnya suhu rektal sampai 39,7 dan 39,9 derajat celcius. kelinci kontrol yang diberi perlakuan dengan PBS tidak menunjukkan fluktuasi yang signifikan dari suhu tubuh awal.

Kesimpulan

meskipun tingkat kemurnian LPS adalah ukuran yang paling baik dalam sistem pemurnian, aktifitas fungsional dari produk akhir juga penting. dalam konteks ini, hasil kelinci pirogen dan tes koagulasi LAL jelas terbukti aktifitas fungsional dari produk yang dimurnikan. sebagai kesimpulan, protokal yang disajikan disini dapat digunakan untuk isolasi LPS dengan tingkat kemurnian dan aktifitas fungsional yang tinggi dari strain yang berbeda.